亚洲人妻少妇一区二区三区-视频一区二区中文字幕更新-午夜av一区二区三区精品-中文字幕一区二区肥臀人妻

 引言

      γH2AX 是染色體組蛋白H2A家族的成員之一。在各種理化因素刺激下，細(xì)胞DNA雙鏈發(fā)生斷裂，ATM、ATR等磷脂酰肌醇3-激酶使H2AX上的第139位絲氨酸發(fā)生磷酸化修飾，形成磷酸化的γH2AX 。γH2AX作為一種生物標(biāo)志物可以清楚地反映DNA損傷程度和修復(fù)情況, 被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡研究中, 是細(xì)胞損傷應(yīng)激反應(yīng)的研究熱點之一。常見的γH2AX鑒定分析方法包括免疫發(fā)光法和質(zhì)譜法，但因復(fù)雜預(yù)處理過程會假陽性。因此原位實時檢測細(xì)胞核內(nèi)γH2AX對于準(zhǔn)確評估遺傳毒性至關(guān)重要。SERS技術(shù)具備原位、無損、預(yù)處理簡單、高靈敏度等優(yōu)勢，有望用于γH2AX原位分析。但是，SERS檢測細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)仍面臨巨大挑戰(zhàn)。SERS增強(qiáng)效果與粗糙金屬尺寸相關(guān)，顆粒直徑越大，振蕩頻率和增強(qiáng)效果越好。進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)需要穿過核孔，其限制直徑尺寸為10-30nm，粗糙金屬顆粒尺寸小導(dǎo)致SERS增強(qiáng)效果弱。在現(xiàn)有技術(shù)中，主要通過修改核定位序列實現(xiàn)主動運(yùn)輸至細(xì)胞核來實現(xiàn)核內(nèi)檢測，該技術(shù)提高了進(jìn)核效率，卻因基質(zhì)存在而產(chǎn)生背景干擾。

在本文中，南京師范大學(xué)王琛教授課題組構(gòu)建了一種基于金納米粒子（GNPs）的小型免疫傳感器SERS探針，成功檢測受限靶點γH2AX，評估藥物遺傳毒性。作者利用γH2AX作為限制靶點的特性，構(gòu)建了一種基于小尺寸（15nm）金納米探針的γH2AX免疫傳感器，并用TAT核靶向肽對其進(jìn)行了修飾，以確保高的核進(jìn)入效率。一旦DNA損傷被誘導(dǎo)，γH2AX的局部過表達(dá)通過免疫識別進(jìn)一步募集探針，從而可以原位組裝熱點，將增強(qiáng)拉曼信號用于遺傳毒性檢測。本研究提出了一種研究提出了一種新的SERS檢測受限靶誘導(dǎo)的尺寸轉(zhuǎn)換和熱點形成的方法，用于分析核內(nèi)遺傳毒性標(biāo)志物。該技術(shù)的優(yōu)點在于簡化了SERS探針的結(jié)構(gòu)和操作過程，避免了對含有熱點的系統(tǒng)的額外設(shè)計，從而減少了背景信號，從而為在單個活細(xì)胞水平上原位實時檢測核內(nèi)靶標(biāo)提供了參考。

結(jié)果分析

作者利用γH2AX作為限制靶點的特性，構(gòu)建了一種基于小尺寸（15nm）金納米探針的γH2AX免疫傳感器，探針以4-巰基芐腈（4-MBN）修飾的15nm GNPs為增強(qiáng)顆粒，PEG2000為穩(wěn)定鏈，TAT為穿透肽，γH2AX單克隆抗體為探測識別物，建立為抗-γH2AX@GPMT的SERS傳感器。

實驗時通過TAT穿透肽的小顆粒和核靶向功能進(jìn)入細(xì)胞核，將構(gòu)建的SERS細(xì)胞傳感器與藥物一起孵育。若藥物沒有遺傳毒性探針以分散狀態(tài)分布，拉曼信號弱。相反，如果藥物具有遺傳毒性發(fā)生DNA損傷，產(chǎn)生γH2AX的局部表達(dá)，誘導(dǎo)探針進(jìn)一步免疫識別和聚集，在原位構(gòu)建增強(qiáng)熱點，產(chǎn)生高強(qiáng)度拉曼信號實現(xiàn)遺傳毒性鑒定。

圖1 （A）抗-γH2AX@GPMT制備原理圖；（B） GNPs的ζ電勢圖；（C）不同GNPs紫外-可見光譜圖；（D）不同基質(zhì)拉曼光譜圖（1592cm^-1和2230 cm^-1是4-MBN特征峰）；（E）抗-γH2AX@GPMT的TEM圖像；(F) anti-γH2AX@GPMT的EDX圖

圖2 （A）抗-γH2AX@GPMT的檢測策略.（B）TAT修飾不同尺寸SERS基底Au尺寸分布（C）15nm抗-γH2AX@GPMT在2230 cm^?1處的暗場、明場和拉曼光譜圖（D）30 nm抗-γH2AX@GPMT在2230 cm^?1處的暗場、明場和拉曼光譜圖（E）MMS孵育前后SERS強(qiáng)度差值。（F）抗-γH2AX@GPMT的MMS平均需求量

圖3 （A）γH2AX靶點體外模擬方案略.（B） γH2AX尺寸與PH值關(guān)系（C）加入抗-γH2AX@GPMT.后實物圖（D）不同PH值孵育環(huán)境下，抗-γH2AX@GPMT的拉曼光譜。（E） 抗-γH2AX@GPMT在2230cm^-1拉曼強(qiáng)度與PH值關(guān)系。（F） 不同濃度的γH2AX肽孵育的抗-γH2AX@GPMT的拉曼光譜圖（G）抗-γH2AX@GPMT在2230cm^-1拉曼強(qiáng)度與γH2AX肽濃度關(guān)系

圖4 抗-γH2AX@GPMT的靶誘導(dǎo)機(jī)制.（A）加入γH2AX肽前后抗-γH2AX@GPMT的TEM圖像（B） 抗γ的生物TEM圖像H2AX@GPMTγH2AX孵育前后。（C）抗-γH2AX@GPMT拉曼光譜（D）抗-γH2AX@GPMT的2230 cm^?1拉曼光譜歸一化強(qiáng)度

圖5 SERS傳感器優(yōu)化和表征。（A）不同時間下細(xì)胞攝取抗-γH2AX@GPMT顯微圖像（B） 加入GNP和抗-γH2AX@GPMT后L02細(xì)胞活性（C）不同傳感器的CYP450代謝酶活性。

圖6（A）藥物遺傳毒性評價方案。（B） 在不同時間MMS孵育時間細(xì)胞暗場、明場和拉曼Mapping圖（2230 cm^?1峰位）。黃色實線區(qū)域為拉曼采集區(qū)。黃色虛線圓圈表示細(xì)胞核區(qū)域（C）在不同時間MMS孵育時間細(xì)胞暗場、明場和拉曼Mapping圖（2230 cm^?1峰位）。（D） 不同孵育時間下2230 cm^?1的拉曼平均強(qiáng)度

結(jié)論

本研究以γH2AX為細(xì)胞核內(nèi)定向靶點，突破了SERS探針進(jìn)入細(xì)胞核效率和信號增強(qiáng)因子之間的局限性。構(gòu)建了一種基于GNP探針的γH2AX免疫傳感器來評估藥物遺傳毒性。該傳感器具備TAT膜穿透性和核靶向功能，使小顆粒探針能夠穿過核孔并成功進(jìn)入細(xì)胞核。該探針進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)后，GTIs誘導(dǎo)DNA損傷和γH2AX局部過表達(dá)，導(dǎo)致原位構(gòu)建增強(qiáng)熱點并產(chǎn)生強(qiáng)拉曼信號，進(jìn)一步增強(qiáng)了探針的免疫識別性能，解決了小探針增強(qiáng)性能差和大探針入核效率差的矛盾難題。本文所設(shè)計SERS探針可原位分析細(xì)胞核內(nèi)遺傳毒性，為藥物遺傳毒性篩選提供了一種新方法，也為細(xì)胞核內(nèi)原位實時檢測提供了實驗靈感。

南京師范大學(xué)王琛教授課題組簡介

王琛，南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師，國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金獲得者（2020年），江蘇省“青藍(lán)工程"優(yōu)秀青年骨干教師、中青年學(xué)術(shù)帶頭人；南京師范大學(xué)本科、碩士，2011年博士畢業(yè)于南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院生命分析國家重點實驗室，2012-2016南京大學(xué)從事物理學(xué)博士后，2016-2017年麻省理工學(xué)院（MIT，美國）訪問學(xué)者。至今，在Angew. Chem. Int. Ed., Sci. China Chem., Nano lett., ACS Nano, Anal. Chem.等學(xué)術(shù)期刊發(fā)表研究論文60 余篇；參編英文圖書 《Nanobiosensors: From Design to Applications》(Wiley)；主持多項國家自然科學(xué)基金、江蘇省重點研發(fā)、江蘇省自然科學(xué)基金等項目；擔(dān)任Chinese Chemical Letters期刊編委，中國分析測試協(xié)會青年學(xué)術(shù)委員會委員，江蘇省材料學(xué)會副秘書長。

文章信息

本文以“Confined Target-Triggered Hot Spots for In Situ SERS Analysis of Intranuclear Genotoxic Markers"為題發(fā)表在Analytical Chemistry上，中國藥科大學(xué)韓凌飛為第一作者，南京師范大學(xué)王琛教授和中國藥科大學(xué)柳文媛教授為通訊作者。

本研究采用的是北京卓立漢光儀器有限公司RTS2 多功能激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，如需了解該產(chǎn)品，歡迎咨詢。

免責(zé)說明

北京卓立漢光儀器有限公司公眾號所發(fā)布內(nèi)容（含圖片）來源于原作者提供或原文授權(quán)轉(zhuǎn)載。文章版權(quán)、數(shù)據(jù)及所述觀點歸原作者原出處所有，北京卓立漢光儀器有限公司發(fā)布及轉(zhuǎn)載目的在于傳遞更多信息及用于網(wǎng)絡(luò)分享。

如果您認(rèn)為本文存在侵權(quán)之處，請與我們聯(lián)系，會第一時間及時處理。我們力求數(shù)據(jù)嚴(yán)謹(jǐn)準(zhǔn)確，如有任何疑問，敬請讀者不吝賜教。我們也熱忱歡迎您投稿并發(fā)表您的觀點和見解。